瓊脂糖凝膠蛋白分離層析過(guò)濾蛋白質(zhì)純化介質(zhì) NiNTABead6FF蛋白純化

   交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，配體與Ni NTA Beads相同。Ni NTA Beads 6FF除了可以耐受苛刻的試劑條件外，因其耐壓的基質(zhì)，可以耐受高達(dá)0.3 MPa的壓力，更穩(wěn)定，因此該產(chǎn)品更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化，可以在相對(duì)較高的流速下，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的純化。

2.純化流程

2.1 緩沖液的準(zhǔn)備

可使用下列推薦緩沖液，也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高 pH上樣，低pH 洗脫。緩沖液在使用前最好用0.22 um 或者0.45 um 濾膜過(guò)濾。因?yàn)?Ni NTA Beads 6FF 可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需緩沖液不同。具體配置方法見(jiàn)表3、表4和表5。

2.2 樣品準(zhǔn)備

2.2.1 細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1）挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說(shuō)明，加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2）表達(dá)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7，000 rpm（7，500×g），離心 15min 收集菌體，然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10（W/V）加入Lysis Buffer，加入終濃度為1mM的 PMSF。加入溶菌酶（工作濃度為0.2-0.4 mg/ml，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶），（同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹(shù)脂的結(jié)合）。

3）將菌體沉淀懸浮起來(lái)，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲

破碎細(xì)胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10.000 rpm（15.000×g），4℃離心20-30 min。取上清，置于冰上備用或-20℃C保存。

2.2.2 酵母、昆蟲(chóng)和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1）將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯，5，000 rpm（3，800×g），離心10 min，收集菌體得上清，如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。

2）對(duì)于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.2.3 包涵體蛋白純化（變性條件）

1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7，000 rpm（7，500×g），離心 15min 收集菌體，去掉上清。

2）按照菌體∶Lysis buffer（不含 8M 尿素）=1∶10（W/V）將菌體懸浮起來(lái)混勻，冰浴超聲破碎。

3）將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10，000 rpm（15.000×g），4°C離心20-30 min。去掉上清，步驟2和3可以重復(fù)一次。

4）按照菌體∶Lysis buffer（含8M 尿素）=1∶10（W/V）將包涵體懸浮起來(lái)。

5）變性條件下進(jìn)行His 標(biāo)簽蛋白純化，具體緩沖液配方見(jiàn)表4、表 5。

2.3 Ni NTA Beads 6FF的裝填

2.3.1重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2）將 Ni NTA Beads 6FF 混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的一半），打開(kāi)下出口流干保護(hù)液。

3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4）裝入潤(rùn)洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒(méi)有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液，4-30℃保存。

2.3.2 中壓層析柱的裝填

Ni NTA Beads 6FF被廣泛應(yīng)用于工業(yè)純化，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝，下面介紹 Ni NTABeads6EF填裝層析柱的方法。裝柱前根據(jù)層析柱直徑計(jì)算柱子底面積，根據(jù)所需裝柱高度計(jì)算所需介質(zhì)體積，公式如下;  V=1.15022h

• V∶所需介質(zhì)體積 ml

• 1.15∶壓縮系數(shù)

• r∶柱管半徑 cm 

• h∶裝填高度 cm

瓊脂糖凝膠蛋白分離層析過(guò)濾蛋白質(zhì)純化介質(zhì) NiNTABead6FF蛋白純化 使用時(shí)的注意事項(xiàng)：

注意∶所取懸液體積應(yīng)為介質(zhì)體積的兩倍，因?yàn)榻橘|(zhì)體積只占懸液總體積的一半，另一半為保護(hù)液。

1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無(wú)氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm 的去離子水。

2）將介質(zhì)懸浮起來(lái)，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3）如果使用儲(chǔ)液器，應(yīng)立即在層析柱和儲(chǔ)液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。4）打開(kāi)層析柱底部出口，開(kāi)啟泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過(guò)層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對(duì)所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個(gè)很好的裝填效果。（注意∶在隨后的色譜程序中，不要超過(guò)最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。5）關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6）如果使用儲(chǔ)液器，去除儲(chǔ)液器，將分配器置于層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開(kāi)始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

2.4 樣品純化流程2.4.1 孵育法純化

1）根據(jù)純化的樣品量，取適量 Ni NTA Beads 6FF 加入離心管中，1000 rpm 離心 1min，吸棄上清;也可加入重力柱中，流干保護(hù)液。2）向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的Lysis Buffer 清洗介質(zhì)，1000 rpm離心1min，吸棄上清;如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干 Lysis Buffer;重復(fù)兩次以上。

3）加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2-4 h或者37℃孵育 30 min-2 h。

4）孵育結(jié)束后，1000 rpm 離心1min，吸棄上清，或過(guò)濾收集介質(zhì)，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5）用5倍介質(zhì)體積的Wash Buffer清洗介質(zhì)，1000 rpm離心1 min 或重力柱管過(guò)濾，去除上清（注意不要吸到介質(zhì)），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

6）加入3-5倍柱體積的Elution Buffer 進(jìn)行洗脫，室溫孵育 10-15min，1000 rpm離心1 min 或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù) 2-3次。

2.4.2 重力柱法純化

1）將裝填好的 Ni NTA Beads 6FF 重力柱用5倍柱體積 Lysis Buffer進(jìn)行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù) 2-3次。2）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時(shí)間至少2 min，保證樣品和介質(zhì)充分接觸，收集流出液，可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3）用 10-15倍柱體積的 Wash Buffer 進(jìn)行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時(shí)可以調(diào)整咪唑的濃度進(jìn)行洗雜。

4）使用5-10倍柱體積的 Elution Buffer洗脫，分段收集，每一個(gè)柱體積收集一管，分別檢測(cè)，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

2.4.3 中壓層析柱法純化

Ni NTA Beads 6FF裝填好后，可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。

1）將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開(kāi)下出口，將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。

2）用 3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲(chǔ)存緩沖液。

3）使用至少5倍柱床體積的 Lysis Buffer 平衡色譜柱。

4）利用泵或樣品環(huán)上樣。注;樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會(huì)導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過(guò)柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進(jìn)樣器更難使用。

5）用Wash Buffer 沖洗柱子，直到紫外吸收達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個(gè)柱體積）。

注∶在樣品和結(jié)合緩沖液中加入咪唑可以提高樣品純度。

6）用Elution Buffer采用一步法或線性梯度洗脫。

一步洗脫中，通常5倍柱體積洗脫液就足夠了。梯度洗脫可以用一個(gè)小的梯度，例如20 倍柱體積或更多，來(lái)分離不同結(jié)合強(qiáng)度的蛋白質(zhì)。

上述步驟介質(zhì)洗脫結(jié)束后，先用 Lysis Buffer 沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用20%乙醇沖洗2個(gè)柱體積，然后將介質(zhì)置于2-8℃保存。

2.5 SDS-PAGE 檢測(cè)

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用 SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

3.在位清洗

當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)反壓過(guò)高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需要進(jìn)行在位清洗操作（Cleaning-in-Place，CIP）。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類(lèi)

通過(guò)使用 30%異丙醇清洗 5-10個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為 15-20 min 可以去除此類(lèi)污染物。然后，再使用 10倍柱體積的去離子水清洗。也可

以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液，清洗填料2倍柱體積。例如，含有0.1-0.5% 非離子去污劑的0.1M 醋酸溶液，接觸時(shí)間為 1-2 h。去污劑處理后，需要使用70%的乙醇清洗5個(gè)柱體積，以*去除去污劑。最后使用10倍柱體積的去離子水清洗。去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用1.5M NaCI溶液清洗 10-15 min。然后，再使用去離子水清洗 10個(gè)柱體積。

4.填料再生

組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺，或者填料載量明顯變低時(shí)，需要進(jìn)行對(duì)填料進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi)，按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

1）使用5倍柱體積去離子水清洗填料;

2）使用5倍柱體積 100 mM EDTA （pH 8.0）剝落鎳離子;3）使用 10倍柱體積去離子水清洗填料;

4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積，停留 10-15min;5）使用去離子水清洗填料，直至 pH中性;6）使用3-5倍柱體積 100 mM NiSO4再生掛鎳;7）使用10倍柱體積去離子水清洗;

填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要將填料懸浮于等體積的 20%乙醇中，置于4-30°℃ 保存。

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