1. 取 PCR 產(chǎn)物（此次為 200 ul），加入 50 ul 酚，加入 50 ul 氯仿/異戊醇（分相上層應(yīng)該是澄清的，如果不是澄

清，可以再次離心 5 min，將澄清上清取出）；

2. 劇烈振蕩（100 bp 的小片斷沒有必要?jiǎng)×艺袷帲靹蚝?，離心 6000－8000 轉(zhuǎn)（一般大片斷離心 10000 rpm），

5 min。（只能離心 5 min，過久的話就會(huì)酚變成沉淀）；

3. 取上請(qǐng)，不要吸到中間箱，吸取后再在棄液中加入雙蒸水，再次離心，收集上清，反復(fù)兩次；

4. 上請(qǐng) 2 倍體積的 100％乙醇以及 0.2 倍體積的 NaAc 沉淀，-20oC（1 h 也可以）過夜沉淀（異丙醇效果更好，

但是不純）；

5. 12000 轉(zhuǎn)，離心 20min，棄去上請(qǐng)。70％乙醇清洗一次，離心，12000 rpm，10 min，重復(fù)洗滌 1－2 次（多

洗幾次除去酚雜質(zhì)）；

6. 棄去乙醇，充分晾干，雙蒸水融解。

2.13. 大腸桿菌菌落 PCR

1．取適量 PCR 薄壁管，置于冰上，每管先加入 17.3ul 的滅菌水。

2．用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。

3．依次加入：

10xBuffer 2.5

MgCl2（25mM） 1.8

DNTP（2.5mM） 1

T3 引物（10pmol） 1

T7 引物（10pmol） 1 33

Taq 酶 0.4

各試劑均加好后，離心機(jī)上甩一下，使之沉底，置于 PCR 儀上

4． 94℃ 2 min

94℃ 4 min

94℃ 40 s

53.6℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)

72℃ 4 min

72℃ 10 min

4℃ 24 h

5．待 PCR 反應(yīng)進(jìn)入 4℃后，取下 PCR 薄壁管，取 7ulPCR 產(chǎn)物加入 3ul 溴芬蘭跑電泳，同時(shí)上 1Kb DNA ladder。

半小時(shí)后照相，觀察膠圖，根據(jù)膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。

6．將快速鑒定和菌落 PCR 檢測(cè)合格的文庫(kù)送檢。不必要額外煮沸。只需要挑取少許克隆，在配好的 PCR 反應(yīng)

液中涮幾下，然后用正常的 PCR 反應(yīng)程序即可。因?yàn)樵?PCR 第一個(gè)循環(huán) 94°變性的步驟中（正常設(shè)置為 4-5min 即

可），質(zhì)?；蚧蚪M肯定有釋放，也足夠 PCR 反應(yīng)的模板用量了，這個(gè)我每天都在做，還沒有做不出的時(shí)候。

只需要挑取少許克隆，在配好的 PCR 反應(yīng)液中涮幾下，然后用正常的 PCR 反應(yīng)程序即可。因?yàn)樵?PCR 第一個(gè)

1. 沾有菌落的牙簽在 PCR 反應(yīng)液中涮過之后，還可以直接扔到 LB 培養(yǎng)基中用來接種（問題不大，重組質(zhì)粒一般都

含抗性的）。

2. 在做菌落 PCR 的時(shí)候，每次都要做陰性、陽性對(duì)照，陽性對(duì)照可以用抽提好的質(zhì)?；蚧蚪M，這樣可以確定 PCR

主反應(yīng)液的配制沒有問題，不會(huì)因?yàn)榫?PCR 陰性而懷疑 PCR 的反應(yīng)；陰性對(duì)照加一點(diǎn)水或者什么都不加，這樣可

以幫助識(shí)別 PCR 反應(yīng)是否有假陽性產(chǎn)生的可能；如果偷懶的話，陰性對(duì)照可以不做，但陽性對(duì)照則是必須要做的。

3. 再告訴大家一個(gè)偷懶的菌落 PCR 鑒定的方法：按照每次反應(yīng) 15-20 ul 的體系計(jì)算好 PCR 各反應(yīng)組分的量/次，

然后一次性配制 100 次或 50 次反應(yīng)的量，做成 Ready-to-use 的 PCR 主反應(yīng)液（除 Primers、Taq 酶不加，模板

用的是菌落），每次做菌落 PCR 的時(shí)候，只需要根據(jù)反應(yīng)的個(gè)數(shù)，吸取相應(yīng)的 PCR 主反應(yīng)液，補(bǔ)加相應(yīng)的 Primers、

Taq 酶，再分裝即可。這樣的好處有二：即開即用，節(jié)省時(shí)間；另外反應(yīng)組分均一，可減少實(shí)驗(yàn)批次之間的誤差。

用槍頭挑取半個(gè)菌落，加入 MIX(除了模板其他的都有），平板放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。等 PCR 結(jié)果出來了，直接

  還可以采用菌落裂解電泳的方法直接挑取重組子。一般目的片段如果不是很小，空載體和重組載體比較容易區(qū)分的

話，都可以采用這種方法。 將菌落培養(yǎng)時(shí)間稍微延長(zhǎng)，挑取半個(gè)菌落加入裂解液中，同時(shí)挑取藍(lán)斑（如非蘭白斑，

直接取空載體質(zhì)粒）作為對(duì)照，電泳即可區(qū)分。 這個(gè)方法有現(xiàn)成的試劑盒，也可以自己配制。

  菌落 PCR：我的做法是用槍頭挑菌落，在分裝好的 pcr 反應(yīng)體系（除了 Taq 酶）中吸幾下，然后在 100 度 5 分鐘裂

解后加入 Taq 酶，然后就可以進(jìn)行 pcr 循環(huán)了。