實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)作為分子生物學(xué)領(lǐng)域中重要的實(shí)驗(yàn)室儀器，已廣泛應(yīng)用于各類生物學(xué)研究。然而，由于操作不當(dāng)，許多研究人員在實(shí)驗(yàn)中遇到了數(shù)據(jù)精度不高、重復(fù)性差、可信度差等問題。本文針對(duì)這些問題，從引物操作技巧、反應(yīng)體系配制技巧、陰性對(duì)照技巧以及結(jié)果分析技巧四個(gè)方面，詳細(xì)介紹了使用熒光定量PCR儀時(shí)如何優(yōu)化qPCR實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
一、引物的操作技巧
使用熒光定量PCR儀在進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。使用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，需在操作界面上設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)，擴(kuò)增子參數(shù)一般設(shè)定范圍為80～200bp。擴(kuò)增子長度越短，擴(kuò)增效率越高，可選擇設(shè)定在110bp。引物一般由試劑公司合成，為干粉狀態(tài)，在溶解前，最好用高速離心機(jī)低溫快速離心30s，使得引物干粉匯聚到管底，避免損失引物。收到引物后，需要先摸索引物的退火溫度和終濃度，以達(dá)到較理想的qPCR擴(kuò)增效果，其次測(cè)定引物的擴(kuò)增效率。
二、反應(yīng)體系配制技巧
正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣本至少3個(gè)重復(fù)，為了消除各重復(fù)之間的系統(tǒng)誤差，將所需的所有試劑和模板加在同一個(gè)PCR管中，充分渦旋混勻后，再分裝到3個(gè)重復(fù)孔中，這樣可有效減小系統(tǒng)誤差。另外，建議使用20μL以上的反應(yīng)體積，以消除由于加樣不準(zhǔn)造成的系統(tǒng)誤差。
三、陰性對(duì)照的技巧
陰性對(duì)照一般是指用水代替模板的反應(yīng)孔，體系中除了模板，包括了其他的反應(yīng)組分。由于qPCR的高靈敏性，陰性對(duì)照有出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的情況，那么在針對(duì)這類問題時(shí)，我們需要判斷其原因所在。使用染料法進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先查看陰性對(duì)照的溶解曲線主峰是否跟陽性孔的主峰位置一致。如果不一致，則可能是引物性能不好，無模板或使用低濃度模板下會(huì)出現(xiàn)引物二聚體，這種情況則需要考慮更換引物，保證引物特異性以及擴(kuò)增效率。
四、結(jié)果分析的技巧
使用熒光定量PCR儀進(jìn)行相對(duì)定量分析時(shí)，常用到的是2-ΔΔCq法，但是這種方法比較粗放，因?yàn)樗那疤崾羌俣ㄋ幸锏臄U(kuò)增效率都為100%。更為準(zhǔn)確的定量則需要考慮不同引物擴(kuò)增效率的差別。可先用梯度稀釋的模板測(cè)試各引物的擴(kuò)增效率E，獲得實(shí)際擴(kuò)增效率之后，后續(xù)實(shí)驗(yàn)只需要在軟件中直接輸入擴(kuò)增效率E值，即可計(jì)算更精準(zhǔn)的相對(duì)定量值。
通過對(duì)qPCR技術(shù)中引物操作技巧、反應(yīng)體系配制技巧、陰性對(duì)照技巧以及結(jié)果分析技巧的優(yōu)化，可以在很大程度上提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
Q2000B熒光定量PCR儀采用目前進(jìn)口半導(dǎo)體技術(shù)以及 MARLOW 半導(dǎo)體芯片制造商生產(chǎn)的半導(dǎo)體材料做為核心部件，確保產(chǎn)品的擴(kuò)增速度、分析結(jié)果及系統(tǒng)可靠性，成為目前PCR行業(yè)的主流設(shè)備。它具備多項(xiàng)先進(jìn)功能，其屏幕可90°調(diào)節(jié)，適應(yīng)不同視角需求，確保了操作的便利性；同時(shí)，它通過同步熒光檢測(cè)減少了延時(shí)誤差，提高了數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。設(shè)備自帶10英寸全真彩觸控屏，允許用戶直接在屏幕上編輯、查看和運(yùn)行定量PCR及普通PCR程序，無需依賴電腦。采用新一代半導(dǎo)體升降溫技術(shù)，擁有高達(dá)6°C/SEC的變溫速率和100萬次循環(huán)的使用壽命。頂部檢測(cè)技術(shù)有效屏蔽背景干擾，提高熒光信號(hào)靈敏度和信噪比，兼容白管和透明管，確保結(jié)果的準(zhǔn)確。此外，該還溫度梯度功能，便于優(yōu)化反應(yīng)條件，并支持遠(yuǎn)程操控，實(shí)時(shí)查看實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析結(jié)果。另外，采用SSLPTM短光程靜態(tài)熒光CCD成像技術(shù)，保證了熒光信號(hào)的穩(wěn)定性和靈敏度。更多實(shí)驗(yàn)室儀器請(qǐng)進(jìn)入蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司網(wǎng)站咨詢。
