無論從事何種細胞培養(yǎng)，無菌技術(shù)都是絕對最重要的部分。細胞培養(yǎng)前的無菌處理技術(shù)分為三部分即：①工作環(huán)境及表面的處理；②細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理；③實驗者的操作技術(shù)；還有哺乳動物細胞的處理及維持細胞生長所需要的培養(yǎng)液的無菌處理。

1.工作環(huán)境的無菌處理

在細胞培養(yǎng)早期，研究者可以依靠操作技術(shù)和盡可能地靠近火焰以達到細胞的無菌化，隨著工作環(huán)境的機械學(xué)發(fā)展，其無菌化程度已得到大大提高，免去了實驗者手指被燒灼的痛苦。層流超凈臺是使工作臺無菌化有效的手段，組織培養(yǎng)可在相對密閉而幾乎無對工作面外界氣流干擾的區(qū)域內(nèi)進行。更周密(但較吊貴)的用于隔離無菌場所的設(shè)備就和用于手術(shù)間的設(shè)備相似，通過該場所的空氣均經(jīng)過HEPA過濾層后循環(huán)使用，通過出口處的氣流形式為向下和向外的。超凈臺的使用允許研究者將實驗 室的一角轉(zhuǎn)變?yōu)榻M織培養(yǎng)區(qū)域，這種工作臺甚至在空氣經(jīng)過HEPA過濾的房間中也有其便利之處。空氣源污染主要是由于氣流和煙霧進入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)液污染所致，實際上保持無菌間足夠清潔而無污染物的堆積不太可能，而超凈臺即可提供容易清潔并可保持的良好工作臺。此外，超凈臺在研究者坐方對面的開放的前部形成一種向下的氣流屏障。

   超凈臺正常工作時，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進入超凈臺。超凈臺HEPA過濾層應(yīng)在每年或一年后由被認可的機構(gòu)進行維修。購買超凈臺時應(yīng)一同購買內(nèi)部電源、真空泵和氣體的內(nèi)部出口。在某些情況下，研究者可在超凈臺中安裝空氣噴射裝置；超凈臺通常裝有紫外燈。水平氣流的超凈臺不宜使用，因為氣流直接吹向研究者，而可能導(dǎo)致操作者無率的受到可能來白實驗器材上的病原菌污染。同樣道理，從工作臺吹出的氣流在吹到周圍環(huán)境前也應(yīng)先通過隔離的HEPA過濾層蓄積，達到杜絕細菌和真菌繁殖的目的。工作臺內(nèi)只限放置每日工作所必湍的物品，其他非必需物應(yīng)去除。日常的清潔工作包括用70%乙醇或10%新潔爾滅擦洗工作臺，用一個連接到真空泵的密閉容器作為裝廢棄液的容器。該容器應(yīng)隨操作內(nèi)容改變后進行高壓處理后再放入超凈臺內(nèi)：加入20ml新潔爾滅有助干防止微生物在其中的滋生繁殖，減少廢液的污染度、不要使用開放的燒杯或容器裝廢液，也不宜采用傾倒操作丟弁、廢棄的培養(yǎng)液，因為這操作都可導(dǎo)致廢液的氣霧化，從而能導(dǎo)致微小塵粒再次進入細胞培養(yǎng)瓶中。

2.玻璃器具和塑料制品的無菌處理

  一次性用品。細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿經(jīng)適當(dāng)處理后使細胞更易附著，通常單層細胞培養(yǎng)物在塑料瓶比玻璃瓶中更易附著、生長更快。塑料瓶本身無活性，更適宜在4℃儲存溶液；而凍存管則宜使用玻璃制品，因為其可耐受0℃以下低溫。

  盡管塑料吸管、瓶子比起玻璃器材有其優(yōu)點，但其價格昂貴.因為玻璃制品可反復(fù)使用。但處理玻璃器材設(shè)備有限或沒有的實驗室，選擇塑料制品更為合適。

   利用高壓滅菌器進行組織培養(yǎng)器材的蒸氣滅菌是常用的滅菌方法。玻璃器材應(yīng)采用高壓滅菌后快速風(fēng)干法蒸發(fā)冷凝氣。瓶蓋應(yīng)松松地蓋在瓶口上進行高壓滅菌，瓶子的消毒也可采取瓶口鋁箔包裹，瓶蓋單獨消毒的方法，待冷卻至室溫后在超凈臺中再蓋在瓶口上。玻璃吸管應(yīng)塞上棉花后再進行滅菌，然后置烤箱中烘干以免棉塞殘留水份，應(yīng)遵照高壓滅菌器材生產(chǎn)廠家推薦的有效的高壓滅菌方法進行操作。高壓滅菌法的效果取決于其蒸汽壓力和高熱狀態(tài)。許多溶液(如Tris緩沖液，細胞培養(yǎng)液)不應(yīng)采用高壓滅菌法進行消毒，而用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)液及多種鹽溶液宜采用“緩慢耗竭"及“濕 氣"循環(huán)法以防液體蒸發(fā)。不宜進行高壓滅菌的瓶塞和其他用品可浸泡在70%乙醇中進行消毒，并在超凈工作臺上吹干。

3.無菌操作

  無菌操作的原則就是保證細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶內(nèi)部以及吸管包裹層等內(nèi)部的無菌狀態(tài)。細胞培養(yǎng)需要比外科手術(shù)更加嚴格的無菌操作，因為離體細胞沒有免疫防御系統(tǒng)有幾種操作規(guī)程有助于無菌技術(shù)的掌握。細胞培養(yǎng)應(yīng)在超凈工作臺或有空氣濾過裝置的工作間里進行；培養(yǎng)用液或其他溶液不應(yīng)在工作區(qū)以外打開，裝吸管的鐵筒同樣如此勿使用先前已打開的吸管簡里的吸管。一旦筒蓋打開，盡量將筒內(nèi)吸管用完，如當(dāng)天尚未用完，應(yīng)從超凈工作臺內(nèi)取出，補充洗凈的吸管，然后重新進行滅菌處理后備用。超凈臺在實驗完畢后應(yīng)騰空，并用適當(dāng)?shù)南疽翰料醋烂妗?/p>

   對細胞培養(yǎng)者來說，一次性乳膠手套的使用被視為一種安全的象征。但切記手套本身并不需要無菌。細胞培養(yǎng)中液體的吸取，均需機械移液裝置。采用口吸是最大的微生物污染源，更重要的是細胞培養(yǎng)液及成分通過食入或吸入方式進入入體，可能對研究人員造成危害。

   細胞培養(yǎng)中用的各種瓶子僅在超凈工作臺中打開，瓶蓋應(yīng)蓋頂朝下放置于工作臺上，勿將瓶蓋放在非無茵工作區(qū)，如果瓶蓋的邊緣已污染，就可能通過與瓶口的接觸而污染瓶中的培養(yǎng)液或吸管、廢棄吸管、細胞培養(yǎng)瓶等應(yīng)放入可封裝的容器中，對可能含有潛在的生物有害物質(zhì)的物品應(yīng)采用焚燒和/或高壓火菌法進行處理，這是一種大家廣為采用的安全措施。

    濕潤的培養(yǎng)箱是常見的污染源。通常由充滿液體的托盤提供培養(yǎng)箱合適的度，而托盤本身即可導(dǎo)致各種細菌和真菌的污染，這種污染還存在于培養(yǎng)箱壁上和提供氣體的管道上。這些培養(yǎng)箱應(yīng)定期在細胞移至其他培養(yǎng)箱后進行加熱處理(如果有加熱程序的話),或采用70%乙醇擦洗表面，并定期更換輸送C02的管 道。該管子可置于20%的含氯漂白劑中浸泡以達到消毒目的。采用高熱于燥法是一種相當(dāng)有效的消除細菌、真菌甚至真菌孢子的方法。C02培養(yǎng)箱中托盤始終用飽和濃度的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)液體達到盤中的高鹽濃度，既使得細菌不能在其中生長，而又能提供合適的濕度.每周均應(yīng) 補充無菌雙蒸水，而Na2HPO4應(yīng)在無固體鹽出現(xiàn)時加入。

   為了防止細胞系的交叉污染，超凈臺中應(yīng)只進行一種細胞系的操作。較理想的方式是每種細胞系使用兩瓶各自單獨的培養(yǎng)液，以免一旦出現(xiàn)污染導(dǎo)致全部細胞的污染。這點對進行克隆的衍生株或尚未凍存的新建立的細胞系特別重要。超凈工作臺中應(yīng)盡可能不放置任何設(shè)備和器材，以避免由于偶然接觸有菌物品導(dǎo)致的污染。在層流超凈臺中，允許培養(yǎng)液瓶口敞開，因為空氣是經(jīng)過過濾后進入工作臺的，所以進入開口的瓶內(nèi)的空氣是過濾的空氣。但是提倡在培養(yǎng)液不使用時將瓶口蓋緊，以免因為偶爾碰到瓶口或拿放非無菌物品通過開放的瓶頸時使衣袖上或其他非無菌物品的細菌掉落到培養(yǎng)液中。培養(yǎng)箱中的細胞應(yīng)經(jīng)常置顯微鏡下觀察，每周至少兩次，以確定細胞的生長狀態(tài)或有無明顯的污染存在。不再需要的細胞應(yīng)該 立即丟棄，而不是繼續(xù)留在CO2培養(yǎng)箱中。

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