免疫熒光標(biāo)記法

1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測(cè)法

間接標(biāo)記法

1)    制備單細(xì)胞懸液；

2)    細(xì)胞計(jì)數(shù)，取出 1× 106 個(gè)細(xì)胞于試管中；

3)   用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù) >90 ～ 95%；

4)   在試管中加入一抗，（劑量按照說(shuō)明書的要求），孵育 30 ～ 60 分鐘；

5)    PBS 洗滌 1 ～ 2 次， 1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清；

6)   加入二抗，孵育 20 ～ 30 分鐘；

7)   PBS 洗一次， 1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

8)   加 300μl PBS，上機(jī)檢測(cè)(若不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè)， 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定，可放置 1 周)。

直接標(biāo)記法

① ~ ③同間接標(biāo)記法

④在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻，孵育 30 分鐘；

⑤用 PBS 洗 2 次， 1500rpm，離心 3 分鐘，棄上清;

⑥加 300μl PBS(PH=7.4)，上機(jī)檢測(cè)。

2、 細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法

間接免疫熒光標(biāo)記法

1)   取已制備好的單細(xì)胞懸液，用 1 ～ 3%的多聚甲醛固定 30 分鐘（也可 4℃ 保存過(guò)夜 ）；

2)    用 PBS 洗兩次，棄上清；

3)    細(xì)胞膜打孔，加入 0.1%皂素 200μl，室溫 10 分鐘；

4)    用 PBS 洗滌兩次；

5)   加入第一抗體， 室溫 30 ～ 60 分鐘，或 4℃過(guò)夜， 同時(shí)須設(shè)陰性對(duì)照或同 型對(duì)照管；

6)    用 PBS 洗滌兩次；

7)   加入二抗（熒光標(biāo)記的抗體）室溫 20 分鐘，避光；

8)    用 PBS 洗滌 1 ～ 2 次，棄上清；

9)    重懸細(xì)胞于 500μlPBS 中，上機(jī)檢測(cè)。

直接熒光標(biāo)記法

① ~ ⑤同間接熒光標(biāo)記法；

加入熒光素標(biāo)記好的抗體，避光 30 分鐘（同時(shí)做同型對(duì)照管）；

用 PBS 洗滌1~2次，棄上清；

加 300μl PBS 上機(jī)檢測(cè)。

細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法（ 直標(biāo)法）

1)   取出已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液 1× 10 6 個(gè)細(xì)胞于試管中； 2)    用 PBS 洗滌兩次；

3)   加入用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原， 同時(shí)加上陰性對(duì)照管， 室溫孵育 20 分鐘；

4)   在試管中加入 1％～3％多聚甲醛 1ml，固定 30 分鐘；

5)   PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘，棄上清;

6)   打孔，加入 0.1％皂素 200μl 室溫 10 分鐘;

7)   用 PBS 洗滌兩次，棄上清;

8)   加入用熒光素標(biāo)記的抗體，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原（標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素

的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫 20 分鐘孵育;

9)    用 PBS 洗一遍棄上清；

10) 用 300μlPBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)

五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：

1 、對(duì)照組的設(shè)置：

在流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量都是相對(duì)值，不是絕對(duì)值。如需知道絕對(duì)值

時(shí)必須設(shè)置對(duì)照組樣品。對(duì)照組樣品包括有陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

（ 1 ）、陰性對(duì)照的設(shè)置

2 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如做間接標(biāo)記法，可設(shè)置與一抗無(wú)關(guān)的實(shí)驗(yàn)，即在 實(shí)驗(yàn)中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對(duì)照

管，作為陰性對(duì)照。

2 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可設(shè)置理論上的陰性細(xì)胞作為  陰性對(duì)照管， 實(shí)驗(yàn)過(guò)程及步驟與實(shí)驗(yàn)組務(wù)必相同。（做間接標(biāo)記法時(shí) ，

同樣也可同時(shí)設(shè)置“ 陰性細(xì)胞" 的陰性對(duì)照管作為陰性對(duì)照。

2 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，取一管，加

上與實(shí)驗(yàn)抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對(duì)照來(lái)作為陰性對(duì)照。 

（2）、陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置：

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，其設(shè)置方法與陰性對(duì)照設(shè)置相同。

2、幾點(diǎn)建議：

1)   在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 在保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上， 應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)工 序和過(guò)程。由于間接標(biāo)記法的工序多，實(shí)驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng)， 如再加之操作的不熟練 ， 細(xì)胞更容易丟失和受損， 而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。因此，在條件允許的范圍 內(nèi)， 建議盡量做直接標(biāo)記法而不去做間接標(biāo)記法， 以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和準(zhǔn) 確性。

2)    建議送檢細(xì)胞一定要足夠量， 一般要求 1× 106 個(gè)細(xì)胞。不要過(guò)少。因?yàn)椋?/span> 細(xì)胞太少檢測(cè)時(shí)樣本流量相對(duì)會(huì)增大從而影響變異系數(shù)， 結(jié)果也不可信。 細(xì) 胞量也不宜過(guò)多， 因細(xì)胞量太多加入的抗體或染料相對(duì)不足， 結(jié)果也由此受

影響。

3) 同一種細(xì)胞需同時(shí)做雙標(biāo)記時(shí)， 須做雙標(biāo)記的同型對(duì)照， 且兩種抗體所標(biāo)記 的熒光顏色務(wù)必不同。