X-射線衍射法

X-射線衍射技術是鑒定蛋?質(zhì)結構的?標準。XRD可以實現(xiàn)較?的分辨率，通?？梢赃_到1到2埃。因此，它可以提供?常詳細的原?級別的結構信息。然?蛋?質(zhì)晶體的??對XRD來說是?個很?的挑戰(zhàn)，因為不是所有蛋?質(zhì)都能夠形成?質(zhì)量的結晶。對于難以結晶的蛋?質(zhì)，獲得合適的晶體可能需要花費?量時間和努?。這也就是為什么當科學家解析出?個新的蛋?質(zhì)結構通常都可以發(fā)CNS的原因。

蛋?質(zhì)三維結構的精度通常?“分辨率"來表示，單位為埃（?），分辨率衡量了衍射圖像以及計算電?密度圖時看到的細節(jié)?平。如果晶體中的所有蛋?質(zhì)都以相同的?式排列，形成?個晶體，那么其中所有的蛋?質(zhì)分?都會以相同的?式散射X-射線，使衍射圖能夠顯示出晶體的精細細節(jié)。 另???，如果晶體中的蛋?質(zhì)都略有不同，例如由于局部柔性或運動等產(chǎn)?了結構差異，衍射圖案就不會包含那么多的精細的信息。分辨率值為1 ?左右的結構屬于?分辨率結構，其晶體是?度有序的，因此很容易在電?密度圖中看到每個原?。?分辨率?于3 ?的結構僅顯示蛋?質(zhì)鏈的基本輪廓，原?的位置只能通過推測得知。不過，?多數(shù)由XRD解析的蛋?質(zhì)結構都介于這兩極之間。

上圖為不同分辨率下的myoglobin蛋?的電?云密度圖，1.0 ?分辨率下的原?位置清晰可辨； 2.0 ?分辨率下雖然每個原?的位置已經(jīng)?法清晰辨認，但氨基酸殘基整體的形狀仍然清晰， 可以?較準確地確定原?位置；當分辨率來到2.7 ?，氨基酸殘基的形狀已經(jīng)變得模糊，準確 推斷原?位置具有較?困難；對于3.0 ?分辨率的結構，?乎?法從電?云密度圖辨認出殘基 的形狀，僅能看到此處有?個殘基存在。讀者可點擊此處的鏈接??觀察不同分辨率下的電? 云形狀：1A6M（1.0 ?）、106M（2.0 ?）、108M（2.7 ?）、1S0H（3.0 ?）。

核磁共振技術

核磁共振技術通過分析蛋?質(zhì)樣品中的信號來解析蛋?質(zhì)的結構。需要利?特定的同位素標記 ?法（如15N或13C標記）將?標蛋?質(zhì)中的?部分原?標記上，再通過2D相關實驗（如1H[1]15N HSQC或1H-1H COSY）確定原?間的連接關系及三維空間排布?；趯嶒灉y得的NMR數(shù) 據(jù)，使?計算?法和算法對蛋?質(zhì)的結構進?計算和模擬，如分?動?學模擬、模擬退?等得 到蛋?質(zhì)的三維結構模型。

NMR的分辨率通常較低，且?般只能?來分析較?的蛋?質(zhì)?段的結構，通過多次采樣來得 到溶液中蛋?質(zhì)的平均位置。然?，NMR對樣品的要求較為靈活，可以提供有關蛋?質(zhì)動態(tài) ?為、柔性區(qū)域和構象變化的重要信息。

冷凍電?顯微鏡技術

冷凍電?顯微鏡是近年來?速發(fā)展的技術，通過觀察蛋?質(zhì)的冷凍樣品中的電?顯微圖像來解析蛋?質(zhì)的結構。Cryo-EM技術不需要蛋?質(zhì)結晶。相反，它使?冷凍技術來固定溶液中的蛋?質(zhì)構象，從?可以研究?晶態(tài)或?規(guī)則結構的蛋?質(zhì)。在過去，Cryo-EM的分辨率不怎么?，通常只能達到??埃，僅能分辨出蛋?質(zhì)顆粒的?致輪廓。2017年的諾?爾化學獎授予了Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson三位科學家，他們?nèi)叩?作極?地提?了Cryo-EM技術獲得的蛋?質(zhì)圖像分辨率。?前，Cryo-EM技術獲得的蛋?結構可達到數(shù)埃的分辨率，能夠?致看出分?的輪廓與肽鏈?向。PDB數(shù)據(jù)庫中使?Cryo-EM?法解析出的分辨率最?的蛋?質(zhì)已經(jīng)具有原?級的精度，分辨率達到了1.15 ?（PDBID：7A6A），不過，這些?精度的結構僅占極?的?例，?部分結構的精度還處于3-5 ?的中等分辨率下。

由于?需結晶，也不?解析復雜的核磁共振信號，Cryo-EM在?分?和超?分?的結構解析上?常有優(yōu)勢，如?蛋?質(zhì)復合物、膜蛋?和病毒等。此外，Cryo-EM還能夠提供動態(tài)過程的信息，如蛋?質(zhì)的構象變化。

微晶電?衍射技術

除了以上提到的三種技術外，近年來?種新的結構解析?法——微晶電?衍射（Micro-ED）——正?速發(fā)展起來。該技術可以快速、?分辨率的測定?分?化合物和?物?分?的3D結構。其使?電?作為?射光束，在冷凍透射電鏡（cryo-TEM）上獲得電?衍射數(shù)據(jù)。由于Micro-ED采?電???光?作為射線，電?相?光?擁有更短的德布羅意波?，因此其與物質(zhì)作?的強度更強，能夠分析很?的晶體并達到很?的分辨率。通常Micro-ED只需使?約100納?的?晶體，在?分鐘內(nèi)就能完成數(shù)據(jù)采集。并且數(shù)據(jù)采集過程可以直接得到電?的相位信息，??需進?相位重建。數(shù)據(jù)處理??，采?常規(guī)的XRD解析?具就能解析Micro-ED數(shù)據(jù)，這更近?步降低了其應??檻。

    不過，Micro-ED并不太適合?尺?蛋?的結構解析，其更適?于解析短肽以及?分?化合物。例如天然產(chǎn)物的結構解析或藥品?產(chǎn)中對API的分析等。?2013年應?以來，已經(jīng)有數(shù)百篇Micro-ED相關的論?發(fā)表。

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