在細(xì)胞上做基因研究的一般的過(guò)程就是：利用CRISPR-Cas9先做基因除 (Gene Knockout) ，獲得基因敲除細(xì)胞系純合細(xì)胞：然后分析相關(guān)的生物學(xué)表型；最后做為對(duì)照還需要將原敲除的基因回補(bǔ)會(huì)到原細(xì)胞系中，做為對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比。而利用Cas9進(jìn)行細(xì)胞敲除之后，細(xì)胞回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)室要注意哪些問(wèn)題? 特別需要考慮的技術(shù)原理是那些？如何規(guī)劃好實(shí)驗(yàn)流程，下面我們就一步步的進(jìn)一下細(xì)胞其因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的效率/價(jià)格/周期等。

一、敲除細(xì)胞的方式

一般都是純合基因敲除細(xì)胞，當(dāng)然也可以選擇MixClone的方式；純合基因敲除，基本就是目的基因的所有的拷貝都被敲除，沒(méi)有任何一個(gè)完整的基因拷貝可以起作用；這樣的好處就是背景非常干凈，做敲除最大的優(yōu)勢(shì)也得以體現(xiàn)，缺點(diǎn)就是效率較低，對(duì)細(xì)胞系要求較高，必須能夠形成單克隆MixClone細(xì)胞敲除Cell Pool就是成本低，適合大規(guī)模篩選，從整體上看生物學(xué)表型的影響；缺點(diǎn)就是要看效果，有很多時(shí)候效果遠(yuǎn)不如純合基因敲除，背景還在。

MixClone™極大地簡(jiǎn)化了基因編輯流程，周期短至四周，價(jià)格只有RNA干擾的一半；技術(shù)方法和嚴(yán)格的工藝流程控制，基因編輯效率可以高達(dá)80-95%，可直接用于下游基因功能分析。

 

MixClone™的技術(shù)流程

二、細(xì)胞基因敲除的方法選擇

1. 細(xì)胞基因敲除策略一-移碼敲除：

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，單gRNA就可以發(fā)揮作用，成本低；
缺點(diǎn)：鑒定麻煩，需要測(cè)序，難以保證一個(gè)基因有同樣基因型，所以分析麻煩，要保證全都是非3的倍數(shù)的移碼才能夠保證基因敲除，所有很多細(xì)胞系是用移碼做不到的(基因拷貝數(shù)多)。

2. 細(xì)胞基因敲除-Cas9X大片段基因敲除：
優(yōu)點(diǎn)：鑒定簡(jiǎn)單，可以通過(guò)對(duì)敲除片段外部設(shè)計(jì)primer進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，同時(shí)所有的基拷貝都基本能夠?qū)胍恢碌幕蛉笔Вδ芊治龊?jiǎn)單；

缺點(diǎn)：技術(shù)復(fù)雜，需要有雙gRNA對(duì)目的基因片段進(jìn)行切割，而且要中間片段刪除的克隆，成本高、效率較低，其次需要非常多的克隆分析才能有結(jié)果，需要更多的篩選克隆工作量。

總結(jié):

移碼敲除：是在外顯子上切一下，導(dǎo)致非3的堿基缺失或者改變，從而實(shí)現(xiàn)整個(gè)外顯子的蛋白序列的改變(但是對(duì)細(xì)胞有多染色體，多核現(xiàn)象的細(xì)胞，就是多個(gè)基因拷貝的細(xì)胞，這個(gè)基本無(wú)法去干凈) ； 移碼的gRNA作用在外顯子上！

大片段敲除：就是在內(nèi)含子設(shè)計(jì)一對(duì)gRNA，將非3整數(shù)的外顯子整個(gè)片段的刪除，或者是整個(gè)基因片段的刪除; (除了技術(shù)復(fù)雜，貴點(diǎn)，什么細(xì)胞系都能用) ; gRNA一般在內(nèi)含子上切。

三、基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建策略

1. 通過(guò)病毒法穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9+gRNA獲得基因敲除細(xì)胞系的流程: 構(gòu)建載體+包病毒+轉(zhuǎn)染+篩選+克隆+PCR【持續(xù)表達(dá)，周期長(zhǎng)，成本高，效率高】。

2. 通過(guò)質(zhì)粒法瞬轉(zhuǎn)Cas9+gRNA獲得基因敲除細(xì)胞系的流程: 構(gòu)建載體+轉(zhuǎn)染+克隆+PCR 【階段表達(dá)，周期短，成本低，效率低】。

3. 通過(guò)Cas9X*穩(wěn)轉(zhuǎn)獲得的基因敲除細(xì)胞系的流程: 構(gòu)建載體+轉(zhuǎn)染+篩選+克隆+PCR【持續(xù)表達(dá)，周期短，成本低，效率高】。

4. 通過(guò)Cas9蛋白+gRNA獲得基因敲除細(xì)胞系的流程: 轉(zhuǎn)染+克隆+PCR【階段作用，周期短，成本高，效率低】。

總結(jié)可以分為兩類(lèi)：持續(xù)的表達(dá)Cas9+gRNA與階段性表達(dá)Cas9+gRNA兩種。

四、基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的需要特別注意的問(wèn)題
1. 一般都是cDNA的回補(bǔ)99%都是用cDNA來(lái)做回補(bǔ)，除非有錢(qián)的可以使用BAC大片段來(lái)做回補(bǔ)的 (可以考慮一下我們的VIRUS-Free技術(shù))。

2. cDNA會(huì)不會(huì)被gRNA識(shí)別切割? 如果是Cas9持續(xù)表達(dá)的，而且gRNA是作用在外顯子的肯定會(huì)!所以要特別注意做回補(bǔ)的時(shí)候，移碼突變的必須要做cDNA突變(就是同義突變，將CRISPR識(shí)別的PAM序列去掉才行);要不回補(bǔ)的CDNA也會(huì)被切割破壞掉，所以我們不推薦做移碼敲除是有原因的，前面省的錢(qián)后面再花回去。[注意：之前報(bào)道Cas9是可以編輯mRNA的，所以......移碼除技術(shù)的問(wèn)題后面比較復(fù)雜，很多人做回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)到，這個(gè)也是其中原因之一]

Cas9X的所有大片段敲除的切割在內(nèi)含子上，一般沒(méi)有在cDNA上面有識(shí)別切割位點(diǎn)，所以回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)就簡(jiǎn)單很多!

除此之外，Cas9X的核心技術(shù)還具備“0"偏差的將Cas9模塊移除，有需要的科學(xué)家可以向我們提出，我們可以將Cas9模塊在交付的敲除細(xì)胞株里面移除。是不是就更加的放心了?

3. 回補(bǔ)的鑒定問(wèn)題?

要特別注意移碼突變的過(guò)程中，有一定概率出現(xiàn)的WB背景雜帶的問(wèn)題比較麻煩? 回補(bǔ)之后的序列可能會(huì)干擾到回補(bǔ)片段的表達(dá)鑒定。

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