標簽：外泌體 離心分離 外泌體分離 高速離心機 細胞外泌體
在生物流體中發(fā)現(xiàn)的細胞外囊泡包括來自內(nèi)體，多泡體的細胞外泌體（30 nm 至 150 nm）和來自質(zhì)膜的微泡（150 nm 至 1000 nm）。目前已知有多種從生物體液中分離外泌體的方法出了使用高速離心機的離心分離法以外，還有色譜法、超濾過濾法、基于聚合物的沉淀和免疫分離法等。
這些細胞外泌體分離方法提取的外泌體要警惕非外泌體顆粒污染，如凋亡小體、凋亡小囊泡、外泌體和脂蛋白，均會對獲得的外泌體生物活性產(chǎn)生影響。另外，分離方法也會影響細胞外泌體的純度和產(chǎn)量。如果要從培養(yǎng)基中分離外泌體，就要使用無血清培養(yǎng)基或無外泌體胎牛血清。
外泌體分離方法優(yōu)缺點對比：
分離方法 | 分離機制 | 分離技術(shù)優(yōu)勢 | 分離方法缺點 |
差速離心 | 該方法包括幾個離心步驟，旨在去除細胞、大囊泡和碎片并沉淀外泌體。 | 差速離心是用于從生物體液和培養(yǎng)基中分離外泌體的標準且非常常用的方法。 | 當使用血漿和血清等粘性生物流體進行分析時，該方法的效率較低。 |
密度梯度離心 | 該方法將超速離心與蔗糖或碘克沙醇密度梯度相結(jié)合。 | 該方法允許將低密度外泌體與其他囊泡、顆粒和污染物分離。 | 對離心時間非常敏感。 |
尺寸排阻色譜 | 尺寸排阻色譜法根據(jù)大分子的大小分離大分子。它采用填充有多孔聚合物珠的色譜柱。 | 該方法允許大分子和小分子的精確分離和各種溶液的應(yīng)用。與離心方法相比，層析分離的外泌體的結(jié)構(gòu)不受剪切力的影響。 | 該方法需要較長的運行時間，這限制了色譜分離在處理多個生物樣品中的應(yīng)用。 |
過濾 | 超濾膜用于將外泌體與蛋白質(zhì)和其他大分子分離。外泌體群集中在膜上。 | 過濾允許從外泌體中分離小顆粒和可溶性分子。在此過程中，外泌體群被過濾膜濃縮。 | 外泌體可以粘附在過濾膜上，并在以下分析中丟失。此外，由于施加了額外的力以使分析的液體通過膜，因此外泌體可能會變形或損壞。 |
基于聚合物的沉淀 | 該技術(shù)包括將生物流體與含聚合物的沉淀溶液混合、孵育步驟和低速離心。 | 沉淀的優(yōu)點包括對分離的外泌體的溫和影響和中性pH 值的使用。 | 基于聚合物的沉淀方法可共同分離非囊泡污染物，包括脂蛋白。此外，聚合物材料的存在可能與下游分析不兼容。 |
免疫分離 | 應(yīng)用了各種免疫學(xué)方法。與特定抗體結(jié)合的磁珠用于分離外泌體。此外，還開發(fā)了基于ELISA 的分離方法。 | 該方法允許分離所有外泌體或外泌體的選擇性亞型。此外，它還可用于外泌體蛋白的表征和定量。 | 該方法不適用于大樣本量。此外，分離的囊泡可能會失去功能活性。 |
篩分分離 | 篩分分離技術(shù)是通過膜篩選和壓力、電泳等方法進行過濾來分離外泌體。 | 相對較短的分離時間并提供高純度的分離外泌體。 | 分離的外泌體回收率低。 |
表 1。外泌體分離方法比較。
差速離心法：
差速離心法仍是實驗中常用的外泌體分離技術(shù)。
主要步驟如下：
1.使用離心機低速離心來去除細胞與細胞碎片
2.而后增加轉(zhuǎn)速通過離心來消除樣本中較大的細胞囊泡
3.再使用高速離心機進行高速離心，通過離心沉淀的方式提取外泌體。
在這里，需要注意的是生物流體的粘度與分離的外泌體的純度有較強的相關(guān)性。
所以，對于高粘度的生物樣品需要超速離心機進行較長時間的離心操作。
圖 1.差速離心法。
密度梯度離心法
這種方法將超速離心機的超速離心與蔗糖密度梯度相結(jié)合 。具體地說，密度梯度離心用于將外泌體與非囊泡顆粒（例如蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)/RNA 聚集體）分離。因此，該方法將囊泡與不同密度的顆粒分離。足夠的離心時間比較重要，否則如果外泌體部分具有相似的密度，則仍可能在外泌體部分中發(fā)現(xiàn)污染顆粒。
圖 2.用于分離外泌體的纖毛多孔結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)不會讓大于 1 μm 的細胞和其他顆粒進入布線區(qū)域。一些較小的顆粒和細胞碎片可以進入微柱區(qū)域，但被納米纖毛排除，形成直徑為 30-200 nm 的孔。纖毛結(jié)構(gòu)選擇性地捕獲外泌體和小細胞外囊泡。
尺寸排阻色譜分離法
尺寸排阻色譜 (SEC) 用于根據(jù)尺寸而非分子量分離大分子。該技術(shù)應(yīng)用了一種填充有多孔聚合物珠子的柱子，該珠子含有多個孔和隧道。分子根據(jù)它們的直徑穿過珠子。小半徑分子通過色譜柱的孔遷移需要更長的時間，而大分子從色譜柱中洗脫得較早。尺寸排阻色譜可以精確分離大分子和小分子。此外，該方法可以應(yīng)用不同的洗脫溶液。與離心機離心方法相比，色譜分離具有較多的優(yōu)勢，因為通過色譜分離的外泌體不受剪切力的影響，避免了因剪切力所造成的囊泡結(jié)構(gòu)改變。目前，SEC 是一種廣泛接受的分離血液和尿液中存在的外泌體的技術(shù)。
此外，SEC 方法與超濾相結(jié)合已用于分離和分析尿源性外泌體。此外，流場-流分餾結(jié)合紫外分析儀和光散射檢測器已被應(yīng)用于分析外泌體的大小和純度。流場-流分餾結(jié)合拋物線和交叉流來分離外泌體。獲得的外泌體已通過電子顯微鏡和質(zhì)譜檢測。
過濾法
超濾膜也可用于外泌體的分離。根據(jù)微泡的大小，使用超濾膜過濾的方法可以將外泌體與蛋白質(zhì)和其他大分子分離。外泌體也可以通過多孔結(jié)構(gòu)捕獲它們來分離（圖 2）。常見的過濾膜孔徑為 0.8 µm、0.45 µm 或 0.22 µm，可用于收集大于 800 nm、400 nm 或 200 nm 的外泌體。比如微柱多孔硅纖毛結(jié)構(gòu)一般用于分離 40-100 nm 外泌體。在初始步驟中，去除較大的囊泡。在接下來的步驟中，外泌體會群集中在過濾膜上。隔離步驟相對較短，但該方法需要用 PBS 緩沖液對硅結(jié)構(gòu)進行預(yù)孵育。
除標準過濾技術(shù)外，切向流過濾在有效分離外泌體方面也有著嘗試應(yīng)用，通過切向流過濾技術(shù)去除游離肽和其他小化合物從而分離具有確定大小的外泌體。此外，在體外研究和脂肪組織中，也會采用超濾與 SEC 的結(jié)合的方式來分離外泌體。
圖 3.外泌體過濾的篩分模型。通過 (a) 對片上過濾器施加壓力或 (b) 產(chǎn)生電場，迫使外泌體穿過多孔膜，結(jié)合錯流和電泳分選 [來完成篩分。
基于聚合物的沉淀法
基于聚合物的沉淀技術(shù)通常包括將生物流體與含聚合物的沉淀溶液混合、4℃孵育和低速離心。用于基于聚合物的沉淀的較常見聚合物之一是聚乙二醇 (PEG)。這種聚合物的沉淀可以對分離的外泌體產(chǎn)生溫和影響而且可以產(chǎn)生中性的 pH 值。由此，出現(xiàn)了幾種常見的外泌體試劑盒：比如： System Biosciences, Mountain View, CA, ExoQuick™ 等。
研究表明，使用 ExoQuick™ 方法可以快速執(zhí)行，無需額外設(shè)備，只需用高速離心機進行超速離心可以獲得高產(chǎn)量的外泌體。但是此方法的缺點是：非外泌體材料對外泌體分離物的污染仍然是基于聚合物的分離方法的一個問題。此外，分離物中的聚合物可能會干擾下游分析。
免疫分離法：
免疫芯片方法基于表面外泌體受體，用于根據(jù)來源分離外泌體。獲得的外泌體可直接分析或用于 DNA 或總 RNA 分離 。外泌體胞內(nèi)蛋白可用作分離外泌體的特異性標志物。此外，基于 ELISA 的 ExoTEST™ 也可以用于有效分離外泌體。其原理是：使用涂有外泌體抗體的ExoTEST™ 板，可以從各種生物體液中分離出外泌體。該方法適用于常見和細胞類型特異性外泌體蛋白的檢測、分析和定量。
篩分分離法:
該技術(shù)是通過膜從生物液體中篩分外泌體并通過壓力或電泳進行過濾來分離外泌體 （圖 3）。篩分分離法的分離時間較短，但分離的外泌體純度卻處于較高的水平。篩分分離法的缺點在于分離的外泌體回收率較低。
總之，細胞外泌體提取、外泌體分離在腫瘤等研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。細胞外泌體分離方法目前多數(shù)還是采用高速離心機 進行離心分離的技術(shù)方法，然而，其他幾種分離技術(shù)，如過濾法、免疫分離法和篩分法，雖然也能進行外泌體分離，但每種方法都有其局限性，多數(shù)還是僅應(yīng)用于實驗室、科學(xué)研究等領(lǐng)域。
資料來源：蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
